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红细胞冷冻干燥保存

2018-11-13

红细胞冷冻干燥保存


  【摘要】  红细胞冷冻干燥保存较传统的深低温保存相比,有储存期限长,储存运输方便,输注安全可靠等优点。本文从红细胞复杂结构及功能,冻干损伤机制,冻干保护剂的作用机制,红细胞冷冻干燥保存等几方面进行综述。

    

  【关键词】  红细胞;冷冻干燥


  传统的红细胞深低温保存法用甘油作低温保护剂,将红细胞冷冻至-80℃或-195℃冰冻保存,此法可以延长保存期数年。但储存和运输极为不便,需要特殊的低温设备,且在细胞复温后除去低温保护剂时洗涤过程十分繁琐。冷冻干燥法是将含水物质低温下冻结,真空条件下对冷冻物质加热,使其中的水分直接升华、解吸而获得干燥物质的一种新技术。它为红细胞的长期保存提供了一种较好的选择方案。经冷冻干燥的红细胞能够在环境温度下长时间稳定储存,并且容易重新复水而恢复细胞的活性,大大地减少了储存和运输的不便。近年来,冷冻干燥技术已经广泛应用于各种生物材料的长期保存。本文从红细胞复杂结构及功能,冻干损伤机制,冻干保护剂的作用机制,红细胞冷冻干燥保存等作如下综述。


  1  红细胞冻干损伤机制


    红细胞冷冻和干燥过程的剧烈环境变化会产生各种应力,对细胞膜和胞内物质造成极大的损伤,容易导致细胞死亡或失去生物活性及功能。细胞的冷冻损伤由机械效应和溶质效应引起。


  1.1  机械效应  细胞在冷冻过程中,细胞内外形成许多冰晶,冰晶作用于细胞膜,让细胞膜产生许多小孔,使其细胞膜不可逆地丧失半透膜性,这称之为机械剪切破坏,冷却速率越快,机械损伤就越大,这是快速冷冻时细胞损伤的主要原因。


  1.2  溶质效应  当细胞溶液的温度降到其平衡冻结点以下并达到一定的过冷度后,细胞外液首先结晶,水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩,电解质浓度明显增加,如果冷却速度较慢,细胞长时间暴露于高浓度的溶液中,使蛋白质分子中硫氢基(SH)和二硫键(SS)发生相互不可逆的反应,产生蛋白质变性和脱水性死亡,这就是溶质效应,也称化学损伤[1]。


  细胞干燥损伤表现在膜的融合与脂质的相转变。正常生理环境下,细胞膜中磷脂的极性基团与水分子结合形成空间上相互隔开,当水分子被除去后,极性基因的聚合密度增大,产生分子间的强相互作用,利用极性基团间的氢键结合弥补与水分子的氢键结合,导致细胞间及细胞器官间的相互融合,这种强相互作用导致烃链由凝胶相融化形成液晶相的温度,即相转变温度(Tm)增加。这样,干脂膜在室温下处于凝胶相,很容易发生不可逆的相分离[2]。此外,在复水过程中处于凝胶相的脂膜会经历向液晶相的相转变,造成膜的通透性增加,致使细胞内外物质自由地双向交换,导致细胞代谢紊乱。


  2  冻干保护剂的作用机制


  许多生物学家对自然界中存在的,能够在低温和脱水状态下存活的有机体进行了大量的研究,发现它们在生物化学方面的共同特点是其细胞内聚集了大量的双糖,其中最常见的是海藻糖和蔗糖[3],由于冷冻和干燥过程都出现细胞脱水现象,提出了“水替代”学说解释双糖保护机制。认为;生物大分子失去结合水膜后,双糖分子中的羟基能在其失水部位以氢键形式与之连接,形成一层新的保护膜代替失去的结合水膜,让生物分子在物理状态上保持与结合水存在时相似,确保了生物分子的高级结构和功能。这种观点近些年来已作为生物材料干态保存的作用机制被人们普遍接受。另外,双糖的存在还有利于降低脂质的相转变温度。这样,干膜脂质在室温下是液晶相,可避免相分离的发生,且在复水过程中不会经历相转变和双分子层的泄漏。


  近些年来,生物学家发现海藻糖和蔗糖在低水分含量时形成玻璃的事实,又提出了冻干保护的“玻璃化”学说。玻璃化就是生物材料由液态向固态转化过程中没有相变热发生,也就是没有晶体生成的过程,称为玻璃化。首先,生物材料冷冻损伤直接或间接地都是由结晶引起,玻璃化能够在冷冻过程中避免结晶,因此可防止冻结损伤;其次,处于玻璃态的物质具有极高的粘度,当玻璃化的保护剂包围在生物分子的周围时,大分子物质的分子运动和分子变性反应减弱,膜融合等由分子扩散运动形成的损伤受到抑制。因此,生物学家们目前认为:玻璃化是保存生物材料最有效的方法,要想最后解决组织和器官的低温保存,必然通过玻璃化这条途径。要想提高生物材料的冰冻成活率,也必须研究生物材料的玻璃化问题。


  3  红细胞的冷冻干燥保存


    目前,生物学家们对红细胞冻干保存进行了大量的研究和实验。欧美发达国家报道了用含高聚物,碳水化合物和聚阴离子化合物溶液作低温保护剂冻干红细胞的实验情况,验证了不同种类,不同分子量,不同浓度的保护剂的保护效果,探讨了冻结速率,干燥温度以及保护剂对红细胞冻干存活率的影响等,一致认为:目前血液细胞冻干工艺的研究重点是组合冻干保护剂配方的选择。由于不同研究者对冻干复水后细胞恢复率的判断标准不同,目前为止还没有一个公认的结果。我国此项研究刚刚起步。笔者相信随着人们对血液细胞冻干和储存过程中保护机制的不断深入理解,一定会发现既有效,使用起来又方便的保护剂组合。

笔者深信:运用血液学、生物学、工程学等多学科知识综合研究开发,血液细胞冷冻干燥保存技术一定会大大提高,它将有着美好的应用前景。



此信息来自-上海亿倍实业有限公司-作者:上海亿倍  
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